Ritmos circadianos : Significados y analisis
Cronobiología de los accidentes cardiovasculares. 
    [ Mecanismos del enfermar en función del tiempo ]
Variaciones circadianas con repercusión cardiovascular
Métodos para la valoración de la elevación matutina de la presión arterial
Incremento matutino de la presión arterial y daño orgánico
Aproximación cronoterapéutica para el control de la presión arterial 
    [ durante las 24 horas: las horas cruciales ]

Ritmos circadianos: significado y análisis

Ritmos biológicos
Es probable que el concepto de tiempo y periodicidad de los fenómenos naturales y ambientales date ya de la época primitiva. El calendario egipcio se inventó hacia el 4200 a. C. y el tiempo y la variación periódica de los fenómenos biológicos en la salud y la enfermedad ocupaban un lugar muy importante en las doctrinas de los médicos de la antigüedad. Estos conceptos fueros recogidos y ampliados con observaciones propias por los naturalistas griegos. Así, por ejemplo, Aristóteles y más tarde Galeno escriben sobre la periodicidad del sueño y la vigilia, centrándola en el corazón el primero y en el cerebro la segunda. Diversas situaciones nos recuerdan periódicamente la importancia de nuestros relojes biológicos internos. Los cambios de horario que tienen lugar en otoño y primavera son una muestra de ello. Los lunes nos levantamos una hora antes y sólo por ese día pensamos que la hora de la comida llega tarde, hasta que se ajusta nuestro reloj.

No obstante, a lo largo de la historia la aproximación científica a la naturaleza de los ritmos biológicos ha dependido de la disponibilidad de instrumentos de medición como el reloj, el termómetro, el electroencefalograma, etc.

Los ritmos biológicos no constituyen un fenómeno casual ni un seguimiento pasivo de las condiciones ambientales, sino que forman parte de una adaptación al entorno que es fundamental para la supervivencia de las especies. Debe diferenciarse el concepto de ritmo del de ciclo. Este último consiste en la sucesión de acontecimientos que tienen lugar de forma repetitiva siempre en el mismo orden sin tener en cuenta el tiempo en que tienen lugar. Cuando un ciclo ocurre en un intervalo de tiempo constante y previsible se habla de ritmo. La frecuencia nos indica el número de ciclos que tiene lugar por unidad de tiempo, y el período es el tiempo que tarda en repetirse un ciclo. El ritmo puede ser endógeno o exógeno según es generado por el propio organismo o no, aunque hay autores que sólo lo consideran ritmo si es endógeno. Los ritmos se pueden dividir en tres tipos principales según su frecuencia (1,2):

Ritmos circadianos son aquellos que tienen una frecuencia próxima a la diaria, es decir entre 20 y 28 horas. En este grupo se encuentra la mayoría de los ritmos que se estudian en cronobiología. Los ritmos ultradianos son aquellos que tienen una frecuencia superior a la diaria, es decir, un período inferior a las 20 horas. Como ejemplos de ritmo ultradiano cabe citar el latido cardíaco y la ventilación pulmonar. Los ritmos infradianos son aquellos cuya frecuencia es inferior a la diaria, es decir con un período superior a las 28 horas, como es el caso del ciclo menstrual de la mujer. No es infrecuente que una misma variable biológica presente de forma simultánea ritmos de frecuencia diferente. Éste es el caso de la secreción pulsátil ultradiana de algunas hormonas, como el cortisol, que además siguen un ritmo circadiano de 24 horas. 

Ritmos circadianos
La persistencia de ritmos biológicos en condiciones ambientales constantes, esto es de ritmos endógenos, indica la presencia de un reloj endógeno interno o marcapasos que controla la periodicidad de ciertas variables. 

Estructura y fisiología de los ritmos circadianos
El sistema circadiano es el conjunto de estructuras cuya misión consiste en organizar los ritmos de determinados procesos fisiológicos (3,4). Este sistema consta de las siguientes estructuras: 1) el núcleo supraquiasmático (NSQ), 2) las vías aferentes, que conducen la información de señales externas al organismo u otras zonas del sistema nervioso al NSQ y 3) las vías eferentes, que acoplan el marcapasos con los sistemas efectores que producen los ritmos.

En la rata y otros muchos mamíferos, el principal marcapasos endógeno se halla en el NSQ (4, 5). En el hombre, el NSQ se encuentra en las paredes del tercer ventrículo, por debajo del hipotálamo y detrás del quiasma óptico. Las vías aferentes consisten en el tracto retinohipotalámico, el tracto genículohipotalámico, vías procedentes de los núcleos del rafe y de las neuronas tuberomamilares de la hipófisis posterior. Las vías eferentes se pueden clasificar según la zona del sistema nervioso central a la que se proyectan. Entre las vías eferentes que se dirigen al hipotálamo destacan las eferentes al núcleo paraventricular, presumiblemente involucrado en el control de los ritmos de funciones hormonales y autonómicas, eferentes al área preóptica, involucrada en la regulación de la temperatura, balance de fluidos y la conducta sexual y finalmente las eferentes al área retroquiasmática, desde la cual se envían señales a los hemisferios cerebrales (regulación de la conducta), tronco encefálico (regulación autonómica) y a la médula espinal (control sensorial y motor). Por otro lado, las vías eferentes que se dirigen a partes fuera del hipotálamo incluyen las que se proyectan al tálamo (locomoción), sistema límbico (memoria y tono afectivo) y al núcleo geniculado lateral. Este sistema utiliza una serie de neurotransmisores, siendo el GABA el más abundante en el NSQ y en las vías eferentes. El NSQ también sintetiza neuropéptidos como el péptido intestinal vasoactivo, la vasopresina y la somatostatina.

Que el NSQ es el principal marcapasos endógeno viene apoyado por experimentos que demuestran que la manipulación o destrucción del NSQ comporta la alteración de prácticamente todos los ritmos circadianos, sobre todo los correspondientes a la actividad motora, ingestión de alimentos, temperatura central, conducta sexual, ciclo sueño-vigilia y a diversas hormonas, como la ACTH. Esto se produce por la disrrupción tanto de comunicaciones nerviosas como de vías paracrinas o endocrinas. Cuando se inyecta tejido fetal de la zona del NSQ en la parte inferior del tercer ventrículo en animales a los que previamente se había lesionado el NSQ, éstos recuperan el ritmo circadiano de la mayor parte de sus variables, sobre todo de las que no dependen de la creación de nuevas sinapsis (mecanismo humoral). Además, células del NSQ en cultivo mantienen ritmos circadianos metabólicos y de actividad eléctrica (6). No obstante, es probable que el NSQ no sea el único marcapasos endógeno existente, ya que es frecuente observar la presencia simultánea de varios ritmos con períodos diferentes. Así, se ha demostrado, al menos funcionalmente (que no anatómicamente), la existencia de otros osciladores que determinan ritmos que no desaparecen con la destrucción del NSQ. Además, mediante experimentos con lesiones selectivas, se han podido identificar diferentes áreas del NSQ que controlan ritmos diferentes. Así, la estructura funcional del NSQ es la de un sistema oscilador múltiple, donde cada célula puede actuar como un oscilador independiente, mostrando su propio ritmo circadiano en su actividad eléctrica. El NSQ presenta un máximo de actividad de descargas durante el día subjetivo, tanto en animales diurnos como en los nocturnos. Este ritmo se observa tanto in vivo como in vitro, y tanto en células en cultivo como en cortes de tejido. Aunque la existencia del NSQ se ha constatado anatómicamente, no existe consenso sobre los límites precisos de este núcleo. El NSQ tiene unas características propias que están presentes en la mayoría de especies estudiadas, se compone de neuronas de tamaño relativamente pequeño, de axones cortos y campos dendríticos pequeños que presentan una frecuencia espontánea de descarga muy baja. Su actividad no se modifica con los cambios de temperatura. La mayoría de las neuronas del NSQ varían su actividad espontánea en respuesta a la entrada de luz por la retina, generalmente aumentan su frecuencia de descarga de forma proporcional a la intensidad de la luz que llega a la retina (4, 5).

Es muy importante diferenciar los conceptos de marcapasos y oscilador
(1, 2, 7). Un oscilador es cualquier sistema capaz de generar cambios cíclicos. Un marcapasos puede estar constituido por uno o más osciladores. Un oscilador puede no constituir un marcapasos, como ocurre en muchas regiones del sistema nervioso central, mientras que un marcapasos debe ser un oscilador.

Cuando un organismo se encuentra aislado de cualquier referencia temporal externa, es decir, bajo condiciones ambientales constantes, decimos que se encuentra en curso libre (7, 8). El período del ritmo que se manifiesta en curso libre se conoce como período endógeno y se designa con la letra griega tau (t). Si las condiciones ambientales se mantienen constantes, el valor de tau es muy estable, de forma que es una de las características más estables del ritmo de un organismo. El ritmo tau es una característica propia de cada especie que se transmite de forma mendeliana y que por tanto es probable que se encuentre determinada genéticamente. Como la duración de los ciclos circadianos en curso libre no siempre es de 24 horas, debemos referirnos a ellos como días subjetivos que, esto sí, se dividen en 24 horas subjetivas u horas circadianas (1 hora circadiana = tau/24). En este caso nos referiremos a tiempo circadiano (CT, del inglés circadian time) (1, 7, 8).

En cuanto al perfil de los ritmos circadianos, se denominan en base al número de picos que presentan. El patrón más frecuente es el bimodal, como es el caso del ritmo de cortisol plasmático.

Es importante destacar que aunque el valor de tau es relativamente constante y determinado genéticamente, existen factores exógenos que pueden afectar este valor. Entre ellos el más importante, al menos el más estudiado, es la luz ambiental. Cuando un animal se encuentra bajo condiciones ambientales periódicas manifiesta un ritmo circadiano con el mismo período que el entorno. En este caso se dice que el ritmo está encarrilado o sincronizado por el entorno ambiental. Este encarrilamiento significa que el ritmo exógeno no genera ningún ritmo en el organismo, sino que encarrila ritmos endógenos ya existentes. El encarrilamiento surge como necesidad de adaptarse al entorno para un mayor aprovechamiento energético y de recursos y al hecho de que la mayoría de los organismos presentan una tau diferente de 24 horas. La existencia de un mecanismo específico de encarrilamiento es necesario ya que los ciclos de luz varían en su duración a lo largo del año. Los elementos externos que utiliza el organismo como referencias temporales para poder encarrilar sus ritmos se conocen con el término alemán zeitgebers (marcadores de tiempo) (1, 7, 8). El zeitgeber más conocido y universal es, sin duda, la alternancia entre luz y oscuridad. Esta información accede al NSQ a través de la retina y a través del tracto retinohipotalámico. Existen otros elementos que pueden actuar como zeitgebers en determinadas circunstancias y especies animales, como por ejemplo, el contacto social con seres de la misma especie, la disponibilidad de alimento y la actividad motora. Este último tiene gran importancia y deriva de la observación de que la realización de actividad física a determinadas horas es capaz de encarrilar el ritmo de animales sujetos a condiciones ambientales constantes. Para situar un fenómeno en el tiempo, se hace referencia al zeitgeber time, que consiste en contar horas de 60 minutos a partir del momento en que se aplica el zeitgeber. Para considerar que un agente concreto puede funcionar como zeitgeber, debe ser capaz de encarrilar un ritmo controlando su período, con una relación de fases estable, de manera que el cambio de fase máximo que produzca sea igual a la diferencia entre el período del ciclo externo y la tau del ritmo endógeno. Por ello hay que diferenciarlo de la coordinación relativa, que se produce cuando un elemento ambiental cíclico es capaz de producir cambio de fase en el marcapasos endógeno pero no de forma suficiente como para producir encarrilamiento. 

Desarrollo de los ritmos circadianos
El sistema circadiano no está presente en el momento del nacimiento sino que se desarrolla durante el período postnatal (1, 7). En el momento del nacimiento, la mayoría de animales presentan ritmos ultradianos en la mayor parte de sus variables. La maduración de los ritmos comporta un cambio de ritmicidad ultradiana a circadiana. Posteriormente, el ritmo circadiano aumenta su amplitud hasta llegar a la que es propia de la edad madura, aunque la maduración también puede comportar modificaciones en la tau, la forma, el patrón del ritmo circadiano, así como la sincronización con ciclos externos. En el hombre, los recién nacidos presentan un patrón irregular las primeras 4 semanas de vida, entre las semanas 5 y 9 aparece un patrón similar al ritmo circadiano en curso libre y a partir de la semana 16 ya presenta un ritmo de sueño-vigilia similar al del adulto. En la maduración de los ritmos existen una serie de influencias de la madre que ya empiezan en la etapa fetal, y del ambiente, como son la luz y el acceso a la comida. Las características de los ritmos circadianos se mantienen a lo largo de la vida adulta. No obstante, en la vejez, se producen una serie de cambios como son un acortamiento de la tau, una disminución de la amplitud del ritmo circadiano, la aparición de un ritmo ultradiano y una desincronización interna. 

Representación gráfica y análisis de los ritmos circadianos.
Método de cosinor y análisis de Fourier
La caracterización y cuantificación de los ritmos biológicos son aspectos fundamentales en cronobiología. De todos los métodos gráficos que se utilizan en cronobiología, el más utilizado es la doble gráfica, o su equivalente anglosajón double-plot, en el que se colocan, una al lado de la otra, las copias de registros de actividad de 24 horas, de tal forma que las filas representan los diferentes días y el ancho de las columnas corresponde a las 24 horas (1, 7, 8). Con este tipo de gráfico se pueden apreciar muy bien de forma visual diferentes características rítmicas de la variable a estudio como son el período, el patrón, la estabilidad, etc.

Los métodos de análisis de series temporales de datos que se utilizan en cronobiología se agrupan en dos grandes categorías. Por un lado están los análisis en el dominio del tiempo, en los que no es necesario conocer la periodicidad de la serie de datos, y por otro lado se encuentran los métodos de análisis en el dominio de la frecuencia, que se basan en las frecuencias o en los períodos dentro de las series de datos (7). Una serie temporal consiste en el conjunto de observaciones (p.ej. presión arterial) a lo largo de un intervalo de tiempo. Es recomendable que el muestreo de datos se realice de forma uniforme a lo largo del período de interés, de forma que si se pierde algún dato, éste se pueda estimar de forma fiable. Asimismo, la frecuencia de muestreo debería ser como mínimo el doble de la frecuencia más alta que se pretenda estudiar.

Entre los primeros se encuentran la media móvil y la autorregresión (1, 7). La media móvil se basa en asumir que cada valor de una serie temporal se puede obtener a partir de la media ponderada de dos o más valores precedentes. La aplicación que se hace en cronobiología no pretende predecir ningún valor concreto, sino que se utiliza fundamentalmente para eliminar valores extremos y de esta manera homogeneizar o suavizar la gráfica correspondiente. Si los valores de la serie temporal los designamos como xi, se puede obtener una nueva serie de elementos yi mediante la fórmula siguiente:

donde el valor 2n + 1 es la amplitud del suavizado. Básicamente consiste en establecer un intervalo de suavizado en un número relativamente pequeño de puntos de los que se obtiene una media. La aplicación de este método da lugar a una nueva serie en la que se han eliminado picos abruptos, aquellos con períodos inferiores a la mitad del intervalo de suavizado. Este método se puede aplicar utilizando coeficientes (media móvil ponderada).

En el método de autorregresión se asume que cada valor de una serie temporal puede expresarse como una combinación lineal de los valores precedentes y su expresión matemática es x i = c o + c 1 x i-1 en el caso de autocorrelación simple. Este método está estrechamente relacionado con el anterior, utilizándose en este caso con finalidad predictiva.

Dentro de los métodos de análisis basados en el dominio de la frecuencia consideraremos el de cosinor y el análisis de Fourier. En estos métodos se asume la existencia dentro de la serie de datos de uno o más procesos rítmicos con períodos definidos. 

Método de cosinor
El método de cosinor consiste en ajustar los datos experimentales a una función sinusoidal (coseno) y realizar posteriormente una representación gráfica (1, 7, 8, 9). Esto es debido a que cuando se analiza un ritmo circadiano del que no se conoce su naturaleza, el modelo matemático más adecuado es el correspondiente a una función sinusoidal. En el análisis matemático de los ritmos se utiliza una serie de parámetros que es necesario conocer: mesor o media ajustada al ritmo que representa el valor intermedio entre el valor más alto y el más bajo del ritmo ajustado a una función matemática, generalmente sinusoidal (Fig.1). Se utiliza debido a que la media aritmética simple no representa la media del ritmo ya que puede estar sesgada por la diferente densidad de muestreo. En el modelo sinusoidal, el mesor será igual a la media aritmética de los datos sólo si éstos se han recogido a intervalos regulares a lo largo de todo el ciclo del ritmo. 

Figura 1.Representación idealizada del ajuste por el método de cosinor. Los puntos representan los datos experimentales y la curva representa el modelo ajustado. En la figura se representa un ritmo ultradiano (picos episódicos) superimpuesto a un ritmo circadiano.

La amplitud se define como la mitad de la diferencia entre el punto más alto y el más bajo del modelo matemático. Una vez aplicado el modelo matemático apropiado, la situación del ritmo en el tiempo define la acrofase por el punto más alto y la batifase por el punto más bajo en relación a una referencia escogida por el investigador. El tiempo transcurrido entre la referencia y la fase se conoce como ángulo de fase y se expresa en unidades de tiempo o en grados angulares (un período = 360º) en sentido horario. Así, se pueden observar avances o retrasos de fase en un ciclo de diferentes parámetros medidos en diferentes circunstancias. El ajuste de datos a una función sinusoidal se expresa matemáticamente de la siguiente forma:

Y(i) = M + A cos (f +t)

donde t es la variable tiempo, Y(t) es el valor de la variable en el tiempo t, M es el valor medio de la función (mesor), A es la amplitud de la oscilación, f representa la acrofase y es la velocidad angular (Fig. 2). En este método, M recibe el nombre de Mesor (mean estimated statistic over rhythm) y f recibe el nombre de acrofase (fase más alta). El procedimiento matemático consiste en hallar los valores de M, A y f que hacen que la función cosenoidal se ajuste lo máximo posible a los valores experimentales de la variable Y(t). Al igual que en las rectas de regresión, el cálculo se realiza mediante el método de los mínimos cuadrados con una versión linearizada de la ecuación anterior. Se puede aplicar a cualquier serie de datos siempre y cuando se conozca el período del ritmo que se está analizando. Para aplicar este método no es necesario que el muestreo sea regular, aunque es recomendable que se obtengan datos a lo largo de todo el ciclo. Los valores de amplitud y acrofase se representan en forma de vector sobre un círculo horario en el que una vuelta representa un intervalo de tiempo equivalente al período de ajuste de la función, generalmente 24 horas. El origen del vector se encuentra en el centro del círculo, la longitud del vector es proporcional a la amplitud del ritmo y cuyo extremo apunta a la hora del día correspondiente a la acrofase: el vector apunta el momento del ciclo en el que la función ajustada tiene su valor máximo. También se suele representar una elipse que engloba el extremo del vector y que indica la región en la que se encuentra el extremo del vector con un 95% de probabilidad. Esta elipse permite determinar los límites de confianza de la amplitud y de la acrofase. En un mismo círculo horario se pueden representar vectores y elipses de confianza que correspondan a series de datos diferentes. Esto permite comparar las características rítmicas de las dos series, por ejemplo de animales en condiciones experimentales diferentes. Para determinar si los ritmos son significativamente diferentes basta con analizar si las elipses de confianza están superpuestas o no. En el caso de que no estén superpuestas, sería imposible encontrar un vector que explique simultáneamente las características rítmicas de las dos series, por lo que se podría afirmar que los ritmos presentan diferencias estadísticamente significativas entre ellos. En el caso de existir superposición, total o parcial, de las elipses, los vectores no son diferentes entre sí. En el caso de encontrar diferencias significativas entre los dos ritmos, se puede calcular si la diferencia radica en la amplitud, la acrofase, o en ambos parámetros. Una vez ajustada la serie de datos a una función cosenoidal, se pueden restar a los valores de una nueva serie de datos para calcular la varianza residual, que es aquella no explicada por el cosinor y que no debería ser superior al 40% de la varianza total. No obstante, es frecuente que en los registros de presión arterial, el cosinor explique sólo un 40% de la varianza total. Otro aspecto del análisis de cosinor es el llamado cosinor poblacional, que sirve para representar las características rítmicas de una población de individuos. En este caso, el vector que se representa en el círculo horario es la media de los vectores individuales, y la elipse de confianza viene determinada por la nube de puntos determinados por los extremos de los vectores individuales. Al igual que en el análisis de cosinor individual, en el poblacional se pueden comparar los ritmos de poblaciones diferentes.

Figura 2.Definición de los parámetros de una función rítmica sinusoidal ajustada a los datos. A = amplitud, f = acrofase. Ver texto para más detalles.

Análisis de Fourier
El análisis de Fourier se basa en el principio de que toda función periódica se puede descomponer en la suma de infinitas funciones sinusoidales de frecuencias armónicas a la frecuencia fundamental (1, 7, 8, 9). Una función sinusoidal de frecuencia armónica es una función sinusoidal que tiene como frecuencia la frecuencia fundamental multiplicada por un entero. Se considera, pues, que el primer armónico (o la primera función sinusoidal armónica) tendrá la frecuencia fundamental, el segundo armónico tendrá la frecuencia fundamental multiplicada por dos, el tercero multiplicada por tres, etc. En el caso de registros de la presión arterial, se trata de ajustar la serie de valores residuales resultantes del análisis de cosinor a una función cosenoidal de período mitad que el anterior (12 horas). La serie así obtenida se ajusta de nuevo a una función cosenoidal de período un tercio de la original y así sucesivamente hasta que la varianza residual se acerque a cero.

En el análisis de Fourier cada función sinusoidal viene definida por una amplitud, un desplazamiento de fase y un período específicos. La función Y(t) se puede escribir como la suma de sus armónicos:

Y(t) = M + A1 cos (f1 + 1t) + A2 cos (f2+ w2t) + … + Ai cos (fi + it)

donde 1 es la velocidad angular del armónico i, t es la variable tiempo, Y(t) es el valor de la variable en el tiempo t, M es el valor medio de la función, Ai es la amplitud del armónico i y f es la acrofase. La amplitud y fase de cada armónico se determinan con las fórmulas del método cosinor.

El análisis de las potencias de los armónicos mediante la descomposición permite determinar cuáles son los componentes rítmicos más importantes de la serie de datos que se analizan. De la misma manera se puede utilizar para realizar un filtrado de los datos originales, es decir, para eliminar determinadas frecuencias. Así, una vez realizada la descomposición de los datos originales, se puede realizar el proceso inverso eliminando determinadas frecuencias y así volver a la serie original “filtrada”. 

Determinantes genéticos que controlan los ritmos circadianos
Los estudios fisiológicos han sido fundamentales para conocer la manifestación fenotípica de la mayoría de ritmos circadianos. No obstante, en los últimos años los recientes avances de la genética molecular han sido los que han permitido conocer algunos determinantes genéticos de los ritmos endógenos (10). Un sistema que oscila sería aquél que de una forma regular tiene tendencia a apartarse del equilibrio para volver a él periódicamente. Para ello se requiere un proceso que genere productos (proteínas) encaminados a regularlo (elemento negativo) y a su vez a producir un cierto retraso en la ejecución de la retroalimentación (10, 11). Por otro lado requerirá de elementos positivos encaminados a que el oscilador no decaiga (Fig. 3). Todos los osciladores circadianos conocidos utilizan circuitos que se cierran dentro de la propia célula, es decir, que no requieren de interacciones célula-célula. Mediante estudios de mutagénesis de fenotipos circadianos alterados se ha llegado al descubrimiento de los genes period (per) y timeless (tim) de la Drosophila, el gen frequency (frq) de la Neurospora y el gen Clock del ratón (12). Los osciladores utilizan sistemas con elementos positivos y negativos en los que la transcripción de genes reloj da lugar a proteínas (elementos negativos) que actúan para bloquear la acción de elementos positivos cuya función es activar los genes reloj. Así, por ejemplo en el caso de la Drosophila, se han creado modelos moleculares de ritmicidad en mutantes con acortamiento (perS), alargamiento (perL) o anulación (per01) de ritmos de conducta. La expresión de los genes per y tim oscila, tanto a nivel de RNA mensajero como de proteína.

Figura 3.Elementos comunes del funcionamiento de osciladores circadianos. Ejemplos de elementos positivos en circuitos circadianos son los genes Clock y bmal1 en mamíferos. Ejemplos de elementos negativos en circuitos circadianos son los genes period y timeless en drosophila y los genes per1, per2 y per3 en mamíferos. Ver texto para más detalles.

Los componentes moleculares del NSQ tienen su pico de expresión durante el día. Así, la luz induce de forma aguda la transcripción de per. Por otro lado, la luz degrada TIM, lo que proporciona un mecanismo de encarrilamiento lumínico de los ciclos moleculares PER y TIM. Los productos de estos genes (las proteínas PER y TIM) regulan su transcripción. De esto se deduce el siguiente modelo: los genes per y tim se transcriben durante el día subjetivo (pico a la hora circadiana) y los productos PER y TIM se acumulan hasta llegar a un nivel de acumulación de TIM que hace que se estabilice PER (13). Los dímeros PER-TIM entran en el núcleo celular a la hora circadiana 21 e inhiben la transcripción de sus propios genes. Cuando las proteínas se degradan, finaliza esta acción inhibitoria de manera que vuelve a iniciarse la transcripción con lo que se inicia un nuevo ciclo. Esto indica que en este sistema, el reloj se regula por un feed-back negativo que usa factores de transcripción que actúan como elementos positivos y que al interactuar tienen acción inhibitoria (13).

En el caso del ratón, el gen Clock codifica un putativo factor de transcripción, lo que apoya la posibilidad de que CLOCK actúe como elemento positivo dentro de un complejo de feed back negativo de transcripción-traducción, y que podría ser inhibido por el equivalente (mamífero) de PER. El papel de estos genes en la regulación de los ritmos circadianos en mamíferos viene apoyada por la demostración de que los equivalentes mamíferos de per se expresan en el NSQ. La complejidad de este sistema viene reflejada por el hecho de que hasta la fecha se han identificado al menos 3 isoformas de per en el ratón. Un pulso de luz suministrado durante la noche subjetiva produce un aumento rápido y transitorio de expresión de per1 y una inducción retardada de per2, mientras que per3 no se modifica. Se ha demostrado que CLOCK interacciona con BMAL1 y así es capaz de inducir de forma directa la transcripción de per1. Esto constituye la primera demostración de la existencia de elementos positivos en el control de reloj endógeno en mamíferos. Así se cierra el asa de control del ritmo circadiano: los elementos positivos CLOCK y dBMAL activan la transcripción de los elementos negativos per y tim; los productos PER y TIM penetran en el núcleo y acaban inhibiendo la propia transcripción a través de la inactivación de la capacidad de CLOCK y dBMAL como inductores de su transcripción. Las proteínas PER y TIM acaban siendo fosforiladas y se inactivan, con lo que el dímero CLOCK-BMAL1 puede iniciar el ciclo de nuevo. Estudios de expresión de per en mamíferos demuestra que ésta se encuentra avanzada entre 3 y 9 horas en el NSQ con respecto al resto del cuerpo, apoyando el papel regulador de este núcleo. Así, se desprende que el NSQ bien conduce ritmos en células pasivas, no rítmicas, bien coordina osciladores autónomos en células periféricas (14). La regulación del asa circadiana tiene lugar tanto por mecanismos post-transcripcionales como post-traduccionales, por procesos de fosforilación y desestabilización de PER. Además, otros genes parecen ser importantes en la regulación de los ritmos circadianos, como el gen frq de la Neurospora, que se utiliza en función de la temperatura ambiente. Es interesante que la fase del ritmo en el NSQ se encuentra avanzada en 4 horas con respecto a la de los tejidos periféricos.

A pesar que el reloj circadiano reside en el sistema nervioso central en los animales superiores, en los últimos años se han detectado relojes biológicos en tejidos periféricos (14). Así, los túbulos de Malpighio de Drosophila decapitada presentaban ritmos circadianos idénticos a los de PER. Incluso, cualquier tejido cultivado podía ser encarrilado por la luz, indicando que las células no neurales de drosophila son fotoreceptoras. En el caso de los mamíferos, la expresión rítmica de per se puede observar en diferentes tejidos no neurales. Así, fibroblastos y células de hepatoma en cultivo muestran expresión rítmica de per2 que pueden ser encarrilados mediante la aplicación de suero. Las fases relativas de la expresión de per1 y per2 en cultivo son superponibles a las que tienen lugar en hígado in vivo. Estos datos apoyan la noción de que existen marcapasos en múltiples tejidos que son controlados y sincronizados de una forma jerárquica por el marcapasos del NSQ.

Así, en los últimos años se están dilucidando las bases moleculares de los ritmos circadianos. Los relojes biológicos se presentan a la vez como mecanismos ubicuos reguladores del metabolismo en muchos tipos celulares y como reguladores moleculares con efectos claros sobre el comportamiento general de los organismos.

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